案例一

三代+光學(xué)+HIC拯救復(fù)雜基因組—-大麥基因組Nature篇。新鮮出爐的消息，新版大麥基因組又發(fā)nature啦！大麥基因組到底經(jīng)歷了怎樣的困局？到底是什么解救了大麥基因組？后續(xù)大麥基因組還會(huì)發(fā)Nature嗎？重復(fù)序列比例過高如何解決？新技術(shù)的到來更新基因組的必要性到底如何？

大麥基因組的困局：

大麥作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，其在農(nóng)業(yè)上的重要性毋需本編過多描述。大麥基因組破解工作本處于第一梯隊(duì)，為何初版基因組在2012年才發(fā)布呢？原因就是大麥基因組的屬于高重復(fù)的復(fù)雜基因組，通過當(dāng)前技術(shù)是無法很好解決的。雖然只有7條染色體，但是基因組的重復(fù)序列比例高達(dá)84%，同時(shí)基因組大小在5.1 Gb，相比于人，水稻等簡單基因組，技術(shù)上存在很大的難度。和人類基因計(jì)劃一樣，通過集齊全世界科學(xué)家的努力，構(gòu)建了大量的BAC文庫，得到了物理圖，同時(shí)基于遺傳圖譜，得到了初版基因組。雖然通過綜合各種技術(shù)，得到的了基因組序列在4Gb 左右，但其可靠性，準(zhǔn)確性難以保障。就拿二代數(shù)據(jù)來說，當(dāng)時(shí)只組裝出了1.9 Gb contig的序列，指標(biāo)更是無從說起。雖然全世界科學(xué)家的努力不可否認(rèn)也不容質(zhì)疑，但現(xiàn)在看來，初版大麥基因組給人的感覺只能是有勝于無！

到底是什么解救了大麥基因組？廢話不多說，看看人家的組裝結(jié)果（表1）。

文章中使用的技術(shù)手段包括BAC+Illumina+BioNano+HiC+Genetic Map，得到了4.79 Gb基因組序列，最終利用HIC和遺傳圖分別將95%和97%的序列掛到了染色體的水平。相比于初版基因組，組裝水平高了不只是一大截啊，這就是技術(shù)上的勝利！話說，基于此版基因組，預(yù)測出的基因編碼區(qū)至占到了整個(gè)基因組的1.4%，而轉(zhuǎn)座原件（重復(fù)序列的一個(gè)大類）卻占到了整個(gè)基因組的80.8%。所以說，大麥基因組的難度的確大?。≌埧次恼轮忻枋龅慕M裝技術(shù)路線：

• 構(gòu)建87085個(gè)BAC，利用Hiseq 進(jìn)行PE及MP文庫測序得到4.5 Tb二代數(shù)據(jù)，之后將每個(gè)BAC的測序數(shù)據(jù)分別進(jìn)行組裝；
• 通過物理圖譜將BAC間的關(guān)系確定；
• 利用遺傳圖+光學(xué)圖譜，通過組裝好的BAC序列構(gòu)建Superscaffold；
• 利用群體遺傳圖（POPSEQ）進(jìn)行Superscaffold分組（97%分組）；
• 利用HiC進(jìn)行Superscafold排序及定向（95%掛載）；
• 基因組評(píng)估+基因預(yù)測+后續(xù)分析。

文章中做了哪些分析？

1、染色體間外大小臂之間的交互

通過HIC熱圖作者發(fā)現(xiàn)無論是染色體內(nèi)部還是染色體間的長短臂之間都存在較強(qiáng)的交互信號(hào)。按照HIC的原理來說，染色體上空間作用越強(qiáng)則實(shí)際DNA間的物理距離越近，染色體大小臂及不同染色體間的相互作用應(yīng)該是極弱的。為了找出原因，作者通過對大麥葉核間期的細(xì)胞進(jìn)行著絲粒及端粒熒光雜交，發(fā)現(xiàn)所有染色體的端粒和著絲粒在空間上的位置都純在極性，且排列方式也極其相似，不同染色體間的大小臂其實(shí)在空間上距離很近，因此確實(shí)存在染色體內(nèi)外大小臂之間大量的交互作用的可能。

2、染色體上重復(fù)序列及基因密度

利用染色體位置信息，通過對20-mer頻率將染色體進(jìn)行劃分成了三種區(qū)域，每種區(qū)域上在基因密度，重組率，LTR插入時(shí)間以及GC含量上都存在一定的規(guī)律。

3、基因家族分析

通過對大麥基因組進(jìn)行基因家族收縮擴(kuò)張分析發(fā)現(xiàn)，收縮擴(kuò)張的家族中*顯著的部分都與植物防御及抗病相關(guān)。另外，作者對麥芽品質(zhì)相關(guān)的amy家族及糖代謝相關(guān)的SWEET家族進(jìn)行了亞家族分類，多倍化及表達(dá)模式相關(guān)的分析。

4、遺傳多樣性及單體型分析

基因組在分子遺傳育種中具有極其重要的作用，本文中作者對來自歐洲的冬季及春季小麥兩個(gè)群體進(jìn)行了遺傳多樣性及單體型相關(guān)分析。最終發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)群體在不同的染色體位置上的多樣性程度及連鎖強(qiáng)度都存在不同特點(diǎn)。如果沒有一個(gè)好的基因組，很難全面了解群體間的變異情況，會(huì)給功能育種上帶來困難。

大麥基因組還能發(fā)Nature嗎？重復(fù)序列比例過高如何解決？

雖然此版基因組已經(jīng)發(fā)表，但是本編覺得就目前的技術(shù)而言，大麥基因組還是有很大的提升空間。有咩有發(fā)現(xiàn)，此版大麥基因組沒有使用當(dāng)前主流基因組所使用的三代測序技術(shù)？雖然此版本基因組相較于第一版基因組提升較大，但是基因組裝的過于零碎仍舊是事實(shí)。畢竟此版基因組的contigN50才79Kb，而super scaffold N50也才1.9Mb。一旦過于零碎，肯定會(huì)導(dǎo)致許多基因無法被預(yù)測出，這將對后續(xù)基因組的功能解讀及研究增加困難。目前，三代測序技術(shù)在基因組完整性上能夠有很好的發(fā)揮，同時(shí)在基因組結(jié)構(gòu)變異上也能夠有所保障。針對大麥基因組，已經(jīng)有了如此多的數(shù)據(jù)，本編認(rèn)為，如果后續(xù)如果再加入純?nèi)鷾y序數(shù)據(jù)，contigN50達(dá)到Mb級(jí)別是極其輕松的！

案例二

Chromosome-scale assembly of the Sparassis latifolia genome obtained using long-read and Hi-C sequnencing

發(fā)表時(shí)間：2021

合作單位：福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院

發(fā)表期刊：G3（Genes|Genomes|Genetics）

研究背景：隨著工業(yè)化和城市化進(jìn)程的推進(jìn)，多環(huán)芳烴類污染物在水體沉積物中頻繁檢出，給水生態(tài)安全和人類健康造成極大威脅。本研究通過結(jié)合梯度稀釋培養(yǎng)法、傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)以及宏基因組這這下學(xué)分析等多種方法手段，深入解析了黑臭河流沉積物中硫酸鹽呼吸耦合多環(huán)芳烴降解的核心功能微生物組。

測序策略：三代測序（ONT）+Hi-C

研究結(jié)論：通過ONT和高通量染色體構(gòu)象捕獲 (Hi-C) 技術(shù)得到了S. latifolia SP-C菌株基因組完成圖。本次總共產(chǎn)生8.24 Gb的ONT數(shù)據(jù)，S. latifolia的測序覆蓋率為198.08X，通過組裝得到了41.41 Mb的高質(zhì)量基因組，scaffold和contig N50 的大小分別為3.31和1.51Mb。通過Hi-C輔助組裝技術(shù)進(jìn)一步組裝成12條染色體的基因組，這些染色體包含93.56%的堿基，基因組的17.47%由重復(fù)序列組成。此外，預(yù)測了13103個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，其中98.72%的基因獲得了功能注釋，BUSCO評(píng)估完整度為92.07%。在S. latifolia基因組中還鑒定出126個(gè)tRNA、75個(gè)rRNA和36個(gè)其他非編碼RNA，利用OrthoMCL對S. latifolia單拷貝和多拷貝進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)S. latifolia SPC與S.crispa SCP的共同基因多于S. latifolia CCMJ1100，系統(tǒng)發(fā)育顯示，S. latifolia SPC與S.crispa SCP有更緊密的親緣關(guān)系，MCScanX共線性分析證實(shí)了上述結(jié)果。

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